Лаборатория индуцированного рекомбиногенеза

Заведующий лабораторией: кандидат биологических наук Роман Александрович Комахин
Тел. (499) 977-99-63, e-mail: recombination@iab.ac.ru


Лаборатория организована в ноябре 2001 г. До 2009 г. лабораторию возглавлял д.б.н., профессор, академик РАН, РАСХН Александр Александрович Жученко.

Сотрудники

Зайцев Дмитрий Викторович — с.н.с., к.б.н.
Стрельникова Светлана Римовна — с.н.с., к.б.н.
Коновалова Людмила Николаевна — с.н.с., специалист
Беюсова Дария Рафиковна — лаборант исследователь, бакалавр
Иванова Любовь Александровна — лаборант исследователь, бакалавр
Комахина Вера Викторовна — с.н.с., к.б.н.
Криницына Анастасия Александровна — с.н.с., к.б.н.
Шишкина Александра Александровна — с.н.с., к.б.н.


Основные направления исследований.

1. Изучение молекулярно-генетических механизмов мейотической рекомбинации у растений с использованием методов генетической инженерии:
— выяснение молекулярных механизмов мейотической рекомбинации и разработка экспериментальных моделей для ее индукции с целью увеличения биологического разнообразия среди потомства гибридов (на примере томата);
— выяснение механизмов интрогрессии генов хозяйственно-ценных признаков из генома дикорастущих видов в хромосомы культурных растений (на примере томатов) и разработка подходов для ее повышения.
2. Поиск, изучение и создание новых эффективных промоторов для координированной экспрессии рекомбинантных и нативных генов в растениях.
3. Создание методами генетической инженерии, в том числе с использованием методов редактирования генома, сельскохозяйственных растений с агрономически-ценными признаками.


Основные объекты исследований.

Растения культурного томата (Solanum lycopersicum) и дикорастущих видов томатов (S. lycopersicum var. cerasiforme, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium, S. habrochaites и др.), в том числе экспрессирующие рекомбинантные гены или генетические конструкции для изменения параметров мейотической рекомбинации.
Трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum), арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) и картофеля (Solanum tuberosum) с целевыми и селективными генами под контролем новых растительных или синтетических промоторов.
Растения картофеля (Solanum tuberosum) отечественных сортов используются для создания образцов с пониженным содержанием амилозы в крахмале методами редактирования генома.

Основные научные достижения.

Под руководством академика Жученко А.А. впервые в России создана коллекция мутантных, дикорастущих и трансгенных форм томата, являющаяся уникальным инструментом для решения важных генетических и селекционных задач.

Выполнены сравнительные исследования частоты и распределения хиазм в материнских клетках пыльцы (МКП) у пяти диплоидных видов томатов и одного автотетраплоида Solanum pimpinellifolium. Установлено, что в одинаковых условиях произрастания виды Solanum peruvianum, Solanum neorickii и Solanum habrochaites имели более высокую вариацию частоты дистальных хиазм, в то время виды Solanum lycopersicum и S. pimpinellifolium между собой различались только по частоте интерстициальных хиазм. Показано, что общая частота хиазм в МКП растений одного вида является достаточно стабильным показателем рекомбинационного потенциала, не зависящим от условий произрастания. Более вариабельным оказалось перераспределение между дистальными и интерстициальными хиазмами в зависимости от вида растений, года и географических условий произрастания. У автотераплоида частота хиазм на бивалент оказалась ниже, чем у диплоидных растений S. pimpinellifolium, прежде всего, за счет интерстициальных хиазм, частота которых осталась на уровне характерном для диплоидных растений. Сделано заключение, что рекомбинационная пластичность геномов томатов обусловлена перераспределением хиазм вдоль бивалентов, а не изменением их числа в клетке.

Впервые установлено, что экспрессия генов мейоз-специфичных эндонуклеаз SPO11 S. cerevisiae и SPO11-1 A. thaliana в клетках линейных гибридов томата приводит к отклонениям в наследовании маркерных аллелей хромосомы 2 и перераспределяет частоты кроссинговера между ними.

Впервые установлено, что экспрессия гена recA E. coli в клетках трансгенных гибридов томатов приводит к увеличению в 1.5 раза кроссинговера между маркерными генами хромосомы 2. Эти результаты послужили основанием использовать аналогичный экспериментальный подход для повышения кроссинговера между хромосомами разных видов томатов. Установлено, что у межвидовых гибридов томатов, экспрессирующих ген recA, обнаружены негативные взаимодействия между локусами культурного томата и видов S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium и S. habrochaites, в последнем случае приводящие к полулетальному некрозу. Экспрессия гена recA у гибридов с S. cheesmaniae частично их комплементирует и компенсирует среди потомства F2 дефицит рецессивных генотипов в локусе Wv:wv хромосомы 2. В целом кроссоверных генотипов в потомстве F2 было больше у межвидовых трансгенных гибридов, чем у нетрансгенных гибридов аналогичной комбинации скрещивания, однако меньше, чем у линейных гибридов S. lycopersicum.

Вместе с коллегами установлено, что в растениях мокрицы (Stellaria media L.) экспрессия генов антимикробных пептидов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 находится на высоком уровне. Эти результаты заинтересовали нас в связи с возможностью обнаружения сильных и конститутивных промоторов для биотехнологии растений. Нуклеотидные последовательности промоторов pro-SmAMP1 (MF461278) и pro-SmAMP2 (KX196447) были клонированы. Коровая и примыкающая к ней проксимальная области до −455 п.н. относительно сайта инициации транскрипции (TSS) у обоих промоторов идентичны на 94 % и различаются точечными заменами или инсерциями/делециями. По мере удаления от TSS дополнительно к точечным добавляются более протяженные участки несоответствия, в том числе инсерции.

Сравнительные результаты исследования эффективности промоторов были получены в различных видах культурных растений при транзиентной экспрессии и в стабильных трансформантах. Эффективность различных делеционных вариантов промоторов оценивали по экспрессии репортерного гена uidA путем измерения активности его белкового продукта GUS. При транзиентной экспрессии в растениях Nicotiana benthamiana (Domin) самый короткий делеционный варианта промотора pro-SmAMP1 (-119 п.н.) оказался в два раза сильнее, чем аналогичный по размеру промотор pro-SmAMP2 (-121 п.н.). Короткие делеционные варианты обоих промоторов при транзиентной экспрессии в N. benthamiana (Domin) в 2-4 раза превосходили вирусный промотор CaMV35S, а в растениях рапса (Brassica napus L.) и сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) были сопоставимы с ним. Функциональность промотора pro-SmAMP2 показана в каллусах растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.). В гомозиготных линиях трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) промоторы pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 в 2 раза сильнее, чем вирусный промотор CaMV35S. Короткие варианты обоих промоторов по эффективности контроля гена неомицинфосфотрансферазы II при селекции трансгенных растений табака и арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.) на средах с антибиотиком канамицином в рекомендованных концентрациях не уступают дуплицированному вирусному промотору 2хCaMV35S. Короткие делеционные варианты промоторов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 рекомендуются для использования в биотехнологии культурных растений в качестве сильных и конститутивных промоторов.

Значительная идентичность нуклеотидных последовательностей pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 ограничивает их использование в составе одной генетической конструкции для исключения рекомбинации между повторами. Для создания новых регуляторных элементов методом прогулки по хромосоме клонировали промоторы генов α-харпинина pro-SmAMP-X и дефензина pro-SmAMP-D1 мокрицы. Новые промоторы не имеют гомологии с другими известными промоторами и при транзиентной экспрессии сопоставимы по эффективности с вирусным промотором CaMV35S.

Ген pro-SmAMP2 из растения мокрицы (S. media L.) кодирует гевеин-подобные пептиды, обладающие in vitro антимикробной активностью по отношению к некоторым вредоносным микроорганизмам. Эти пептиды играют важную роль в защите растений мокрицы от инфекции, а кодирующий их ген ранее был использован для защиты трансгенных растений арабидопсиса и табака от фитопатогенов. Также ген pro-SmAMP2 под контролем вирусного промотора CaMV35S или под контролем собственного промотора pro-SmAMP2 был трансформирован в растения культурного картофеля двух сортов, различающихся по устойчивости к альтернариозу: Юбилей Жукова (устойчивый) и Скороплодный (восприимчивый). Количественным методом ПЦР в реальном времени было показано, что трансгенные растения картофеля экспрессировали ген pro-SmAMP2 под контролем обоих промоторов на уровне сопоставимом или превышающем уровень экспрессии гена актина картофеля. Методом оценки иммунного статуса трансформантов было показано, что экспрессия гена антимикробных пептидов pro-SmAMP2 способна повышать устойчивость к комплексу фитопатогенов Alternaria sp. И Fusarium sp. только растений картофеля сорта Юбилей Жукова.

Показана возможность выделения необходимого количества жизнеспособных протопластов из растений картофеля (Solanum tuberosum L.) отечественных сортов. Установлено, что уровень эффективности их трансфекции генетической конструкцией pHBT-sGFP-NosT достаточен для успешного проведения экспериментов по редактированию генов картофеля.

Гранты и договоры:

1. РФФИ 19-016-00067-а «Новые эффективные регуляторные элементы на основе промоторов генов антимикробных пептидов растений для биотехнологии сельскохозяйственных культур» (2019-по н.в.).

2. КПНИ «Картофелеводство» (Развитие селекции и семеноводства картофеля) по теме «Разработка метода редактирования генома отечественных сортов картофеля с использованием технологии CRISPR/Cas9 для получения растений с пониженным содержанием амилозы в крахмале» (2018- по н.в.).

3. Государственный контракт № 14.604.21.0028 МОН РФ «Создание нового эффективного инструментария на основе промоторных областей генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для генетической инженерии двудольных сельскохозяйственных культур» (2014-2015).

4. Государственный контракт № 14.512.11.0123 МОН РФ «Создание набора генетических конструкций, содержащих новый растительный промотор и ген антимикробных пептидов proSmAMP2, для получения цисгенных растений, устойчивых к фитопатогенам» (2013).

5. РФФИ 11-04-00873-а «Изучение молекулярных механизмов мейотической рекомбинации (кроссинговера) с использованием трансгенных гибридов томатов, экспрессирующих гены мейоз-специфичных эндонуклеаз SPO11 Saccharomyces cerevisiae и SPO11-1 Arabidopsis thaliana» (2011-2013).

6. Грант Президента Российской Федерации МК-244.2011.4 «Разработка нового метода индукции мейотической рекомбинации между гомеологичными хромосомами в мейозе у отдаленных гибридов с использованием трансгенных растений, экспрессирующих ген бактериальной рекомбиназы recA» (2011-2012).

7. Договор № 01 от 4 августа 2009 г. и № 8-Д2009 от 16 сентября 2009 г. на оказание услуг по проведению стажировки сотрудников Дочернего государственного предприятия «Институт биологии и биотехнологии растений» Республиканского государственного предприятия «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (2010).

8. РФФИ 08-04-13573-офи_ц «Создание модельных трансгенных растений, экспрессирующих гены антимикробных пептидов из Stellaria media, для изучения механизма устойчивости к фитопатогенным грибам с оценкой перспективы практического применения» (совместно с лабораторией стрессоустойчивости ВНИИСБ) (2008-2009).

9. РФФИ № 08-04-13596-офи_ц «Разработка экспериментальных моделей для изучения и индукции мейотической рекомбинации с использованием трансгенных гетерозиготных растений, экспрессирующих ген recA Escherichia coli» (2008-2009).

10. РФФИ № 06-04-08097-офи «Разработка теоретических и экспериментальных моделей механизма экзогенной и эндогенной индукции частоты и спектра рекомбинации у гетерозиготных растений» (2006-2007).

11. РФФИ № 03-04-48878-а «Использование трансгенеза для увеличения генетической изменчивости» (2003-2005.).

Избранные публикации лаборатории

1. Комахин Р.А., Комахина В.В. Компартментализация Spo11p в вегетативных клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Молекулярная биология 2008 Т.42., № 3. c.494-500.
2. Комахин Р.А., Комахина В.В., Милюкова Н.А., Голденкова-Павлова И.В., Фадина О.А., Жученко А.А. Трансгенные растения томата, экспрессирующие гены recA и NLS-recA-licBM3, как модель для изучения мейотической рекомбинации // Генетика. 2010. Т. 46, № 12. с.1635-1644.
3. Комахин Р.А., Комахина В.В., Милюкова Н.А., Жученко А.А. Анализ частоты мейотической рекомбинации у трансгенных гибридов томата, экспрессирующих гены recA и NLS-recA-licBM3 // Генетика. 2012. Т.48, № 1. с.30-39.
4. Shukurov R.R., Voblikova V.D., Nikonorova A.K., Komakhin R.A., Komakhina V.V., Egorov T.A., Grishin E.V., Babakov A.V. Transformation of tobacco and Arabidopsis plants with Stellaria media genes encoding novel hevein-like peptides increases their resistance to fungal pathogens // Transgenic research. 2012. № 2. p.313-325.
5. Стрельникова С.Р., Вобликова В.Д., Шукуров Р.Р., Бабаков А.В., Комахин Р.А. Изучение нового растительного промотора гена proSmAMP2 из Stellaria media методом агробактериальной инфильтрацией растений // Биотехнология. 2014. № 3 с.8-17.
6. Tyurin C.A., Sadovskaya N.S., Nikiforova K.R., Mustafaev C.O., Komakhin R.A., Fadeev V.S., Goldenkova-Pavlova I.V. Clostridium thermocellum thermostable lichenase with circular permutations and modifications in the N-terminal region retains its activity and thermostability // Biochim Biophys Acta. 2015. 1854(1):10-9. doi: 10.1016/j.bbapap.2014.10.012
7. Ветчинкина Е.М., Комахина В.В., Высоцкий Д.А., Зайцев Д.В., Смирнов А.Н., Бабаков А.В., Комахин Р.А. Экспрессия растительного гена антимикробных пептидов pro-SmAMP2 повышает устойчивость трансгенных растений картофеля к возбудителям альтернариоза и фузариоза // Генетика. 2016. Т.52. № 9. с.1055-1068.
8. Высоцкий Д.А., Стрельникова С.Р., Ефремова Л.Н., Ветчинкина Е.М., Бабаков А.В., Комахин Р.А. Структурно-функциональный анализ нового растительного промотора pro-SmAMP1 из Stellaria media // Физиология растений. 2016. Т.63. № 5. с.705-715.
9. Komakhin R.A., Vysotskii D.A., Shukurov R.R., Voblikova V.D., Komakhina V.V., Strelnikova S.R., Vetchinkina E.M., Babakov A.V. Novel strong promoter of antimicrobial peptides gene pro-SmAMP2 from chickweed (Stellaria media) // BMC Biotechnol. 2016. 16(1):43. doi: 10.1186/s12896-016-0273-x.
10. Nguyen M.L., Monakhos G.F., Komakhin R.A., Monakhos S.G. The New Clubroot Resistance Locus Is Located on Chromosome A05 in Chinese Cabbage (Brassica rapa L.) // Russian journal of genetics. 2018. V.54. p.296-304. DOI: 10.1134/S1022795418030080
11. Madzharova N.V., Kazakova K.A., Strelnikova S.R., Snycheva O.A., Vetchinkina E.M., Efremova L.N., Vysotskii D.A., Babakov A.V., Komakhin R.A. Promoters pro-SmAMP1 and pro-SmAMP2 from Wild Plant Stellaria media for the Biotechnology of Dicotyledons // Russian journal of plant physiology. 2018. V.65. p.750-761. DOI: 10.1134/S1021443718040040 v 12. Комахин Р.А., Стрельникова С.Р., Жученко А.А. Генетические особенности маркерной линии культурного томата Мо938 // Генетика. 2019. Т.55. № 1. DOI: 10.1134/S0016675819010089.
13. Стрельникова С.Р., Комахин Р.А., Жученко А.А. Изменчивость частоты хиазм у различных видов томатов // Цитология. 2019. Т.61. № 2. DOI: 10.1134/S004137711902007X
14. Комахин Р.А., Милюкова Н.А., Стрельникова С.Р., Криницына А.А., Комахина В.В., Жученко А.А. Наследование маркерных генов в потомстве межвидовых гибридов томатов, экспрессирующих ген recA Escherichia coli // Генетика. 2019. Т.55. № 4, DOI: 10.1134/S0016675819040064

Партнеры


























События