ГРАНТЫ И ПРОЕКТЫ

В 2016 г. в институте выполнялись исследования по следующим проектам:

Российский фонд фундаментальных исследований (4 проекта):

«О роли белка с доменом холодового шока TsCSDP3 растения-экстремофита Thellungiella salsuginea в молекулярном механизме холодового закаливания»

«Молекулярно-генетический анализ взаимодействия растений с патогенами (на примере фитофтороза картофеля)»

«Эволюция гена FRIGIDA, контролирующего переход к цветению растений семейства Brassicaceae»

«Разработка комплексной системы для сравнительной оценки генотипов томата по солеустойчивости в условиях in vitro»

В 2014-2015 г.г. в институте выполняются исследования по следующим грантам и проектам:

Российский фонд фундаментальных исследований (5 проектов):


«Эволюция NBS-LRR генов устойчивости к фитофторозу у клубненосных видов Solanum»

«О роли белка с доменом холодового шока TsCSDP3 растения-экстремофита Thellungiella salsuginea в молекулярном механизме холодового закаливания»

«Идентификация и структурно-функциональный анализ нового индуцибельного растительного промотора pro-SmAMP1, регулирующего экспрессию гена антимикробного пептида из растения Stellaria media. Поиск регуляторных элементов, определяющих его индуцибельность».

«Участие белка с доменом холодового шока TsCSDP1 в адаптации растения-экстремофита Thellungiella salsuginea к низкотемпературному стрессу»

«Эволюция взаимоотношений растения и патогена: полиморфизм генов эффекторов возбудителя фитофтороза картофеля Phytophthora infestans»

По Государственным контрактам:
с Министерством образования и науки РФ (2 проекта):


«Создание нового эффективного инструментария на основе промоторных областей генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2 из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для генетической инженерии двудольных сельскохозяйственных культур»

«Проведение центром коллективного пользования научным оборудованием ВНИИСБ „Биотехнология“ работ по комплексному молекулярному анализу широкого спектра биологических маркеров для персонифицированной диагностики актуальных заболеваний, а также по производству перспективных лекарственных препаратов на основе модифицированных олигонуклеотидов».

Международные проекты:

в рамках Межгосударственной целевой программы Евразийского экономического сообщества (ЕврАз ЭС) «Инновационные биотехнологии»:

«Разработка биотехнологических приемов модификации ди-, тетра- и гексаплоидных разновидностей пшеницы»

Сведения о ходе выполнения в институте прикладных научных исследований и экспериментальных разработок:

Сведения о выполнении прикладного научно исследования (ПНИ) по теме «Создание нового эффективного инструментария на основе промоторных областей генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2 из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для генетической инженерии двудольных сельскохозяйственных культур»

Целью проекта является создание наборов новых эффективных промоторов для генетической инженерии двудольных растений на основе промоторных областей генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 для получения цисгенных сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды.
«В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 17 июня № 14.604.21.0028 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 «Проведение испытаний экспериментальных образцов трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы» в период с 1 января 2015 г. по 30 июля 2015 г. в соответствии с утвержденными Программой и методиками испытаний выполнялись следующие работы:

2.1. Испытание экспериментальных образцов № 1 — трансгенных растений Nicotiana tabacum поколений Т2-Т4, экспрессирующих целевой ген gus под контролем 5’-делеционных вариантов −2160 и −495 п.н. промоторной области гена рro-SmAMP2;

2.2 Испытание экспериментальных образцов № 2 (рапс Brassica napus) и № 3 (свекла Beta vulgaris), агроинфильтрированных с использованием генетических конструкций, содержащих целевой ген gus под контролем 5’-делеционных вариантов −862 и −495 п.н. промоторной области гена рro-SmAMP2 и промотора CaMV35S.

2.3 Испытание экспериментальных образцов № 4 — трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum, экспрессирующих целевой ген антимкробных пептидов рro-SmAMP2 под контролем 5’-делеционного варианта −2160 п.н. промоторной области гена рro-SmAMP2 и промотора CaMV35S.

2.4 Испытание экспериментальных образцов № 5 — трансгенных растений табака Nicotiana tabacum поколений Т0-Т1, экспрессирующих целевой ген gus под контролем 5’-делеционных вариантов −1200, −700, −650, −603 и −481 п.н. промоторной области гена рro-SmAMP1 и промотора CaMV35S.

2.5 Испытание экспериментальных образцов № 6 — растений Nicotiana benthamiana, агроинфильтрированных с использованием генетических конструкций, содержащих целевой ген gus под контролем 5’-делеционных вариантов −1200, −700, −650, −603 и −481 п.н. промоторной области гена рro-SmAMP1 и промотора CaMV35S.

2.6 Закупка необходимого технологического и контрольно-измерительного оборудования по этапу 2.

2.7. Пуско-наладочные работы на технологическом и контрольно-измерительном оборудовании по этапу 2.

2.8 Материально-техническое обеспечение работ этапа 2.

При этом были получены следующие результаты:

2.1 Высокая активность делеционных вариантов −2160 и −495 п.н. промотора proSmAMP2 сохранилась в трех (Т2-Т4) последовательных поколениях трансгенных растений табака. Оба делеционных варианта промотора pro-SmAMP2 во всех поколениях трансгенных растений табака были существенно более эффективными, чем вирусный промотор CaMV35S. Для модификации растений предпочтительнее использовать генетические конструкции с делеционным вариантом −495 п.н. промотора pro-SmAMP2, показавшим наиболее высокий и стабильный результат при меньших размерах своей нуклеотидной последовательности. Делеционные варианты промотора −2160 п.н. и −495 п.н. могут быть использованы для экспрессии целевых генов в поколениях трансгенных растений, содержащих инсерции Т-ДНК в качестве аллелей.

2.2 Уровень активности GUS в агроинфильтрированных растениях рапса был относительно низким, в сравнении с агроинфильтрированными растениями Nicotiana benthamiana, но выше, чем в растениях свеклы. В некоторых агроинфильтрированных растениях рапса или листьях свеклы эффективность делеционных вариантов −862 п.н. и −495 п.н. промотора pro-SmAMP2 была выше, чем вирусного промотора CaMV35S, или не уступала ему. Эти результаты свидетельствуют, что делеционные варианты −862 п.н. и −495 п.н. промотора pro-SmAMP2 проявляют высокую активность в данных сельскохозяйственных культурах и могут быть использованы для их генетической модификации с целью получения цисгенных растений.

2.3 Уровень экспрессии целевого гена pro-SmAMP2 под контролем вирусного промотора CaMV35S был выше, чем при использовании делеционного варианта −2160 п.н. промотора pro-SmAMP2, при сравнении двух групп трансгенных растений. Индивидуальные растения картофеля, экспрессирующие ген pro-SmAMP2 под контролем его собственного промотора по этому показателю превышали отдельные индивидуальные растения картофеля с промотором CaMV35S. Делеционный вариант −2160 п.н. промотора pro-SmAMP2 является сильным, поскольку обеспечивает уровень экспрессии целевого гена на уровне экспрессии гена «домашнего хозяйства» — актина картофеля. Для достижения целевых показателей ТЗ необходимы дополнительные эксперименты, предусматривающие измерения экспрессии гена pro-SmAMP2 в определенных условиях выращивания и в одинаковую фазу вегетации трансгенных растений картофеля.

2.4 В трансгенных растениях табака двух поколений (Т0-Т1) все пять делеционных варианта промотора pro-SmAMP1 были более эффективными, чем вирусный промотор CaMV35S. Все изученные делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 были активны примерно на одном уровне. В трансгенных растениях табака существовала тесная положительная корреляция между высоким уровнем активности репортерного фермента GUS и уровнем экспрессии кодирующего его гена, находящегося под контролем делеционных вариантов промотора pro-SmAMP1. Промотор растительного гена pro-SmAMP1 сохраняет транскрипционные свойства в ряду поколений трансгенных растений на высоком уровне. Все делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 активны во всех изученных органах (корни, стебли, листья, бутоны, пыльники) трансгенных растений табака на спорофитной и на гаметофитной (пыльца) стадиях развития. Уровень активности делеционных вариантов pro-SmAMP1 различен в разных органах трансгенных растений. Наиболее конститутивным был делеционный вариант −481 п.н. pro-SmAMP1, а наиболее органоспецифичен делеционный вариант −1200 п.н. В целом, все делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 могут быть использованы для создания трансгенных растений нового поколения — цисгенных. Одновременно, следует отметить, что изучаемые делеционные варианты промотора pro-SmAMP1 в трансгенных растениях табака не были индуцибельными. Не было их индукции в листьях трансгенных растений при обработке жасмонатом, фитопатогенными грибами, при переносе асептических растений в почву. Однако у некоторых трансгенных растений поколения Т1р650 была обнаружена аномально высокая активность GUS либо в листьях, либо в стеблях. В связи с этим на Этапе 3 ПНИ в качестве дополнительных экспериментов к запланированным работам по ПГ необходимы сравнительные исследования уровней активности GUS у трансгенных растений табака с различными делеционными вариантами промотора рro-SmAMP1 при обработке корней и стеблей индукторами (жасмонат или фитопатогенные грибы).

2.5 В агроинфильтрированных растениях N. benthamiana все делеционные варианты промотора гена pro-SmAMP1 из мокрицы были с вероятностью 95 % существенно более эффективными, чем вирусный промотор CaMV35S. Применение делеционных вариантов промотора proSmAMP1 для биотехнологии растений приоритетно с точки зрения экологической безопасности, поскольку они могут заменить в генетических конструкциях для трансформации растений промоторы вирусов, бактерий или животных.

2.6 и 2.7 В полном объеме за счет внебюджетных средств проведена закупка и пуско-наладка технологического оборудования (системы кондиционирования воздуха).

2.8 В полном объеме за счет внебюджетных средств выполнено материально-техническое обеспечение работ этапа 2, а именно, приобретены реактивы и расходные материалы.

В целом необходимо отметить, что результаты проекта сопоставимы с мировым уровнем исследований и позволят разработать новые технические решения в области генетической инженерии и биотехнологии растений. Новизна научного решения обусловлена использованием уникальных нуклеотидных последовательностей промоторов генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2 из растения S. media.
Полученные к настоящему времени результаты свидетельствуют о полном их соответствии техническим требованиям к выполняемому проекту, работы по которому должны быть продолжены в соответствии с План-графиком.

Комиссия Минобрнауки России 12 октября 2015 г. признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.




Сведения о ходе выполнения прикладного научно исследования (ПНИ) по теме «Создание нового эффективного инструментария на основе промоторных областей генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2 из сорного растения мокрицы (Stellaria media) для генетической инженерии двудольных сельскохозяйственных культур»
Целью проекта является создание наборов новых эффективных промоторов для генетической инженерии двудольных растений на основе промоторных областей генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2 для получения цисгенных сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды.

«В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 17 июня № 14.604.21.0028 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 «Выбор направления исследований. Теоретические исследования поставленных перед ПНИ задач. Создание экспериментальных образцов трансгенных и агроинфильтрированных растений» в период с 17 июня 2014 г. по 31 декабря 2014 г. выполнялись следующие работы:

1.1 Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.

1.2 Исследование объекта ПНИ. Обоснование выбора направления исследований. Теоретическое исследование путей использования промоторов генов растений, для получения цисгенных растений, устойчивых к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам среды.

1.3 Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.

1.4 Разработка лабораторных методик создания трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы.

1.5 Создание экспериментальных образцов трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы.

1.6 Разработка лабораторных методик измерения экспрессии целевых генов у трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы.

1.7 Разработка Программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы.

1.8 Закупка необходимого технологического и контрольно-измерительного оборудования по этапу 1.

1.9. Пуско-наладочные работы на технологическом и контрольно-измерительном оборудовании по этапу 1.

1.10 Материально-техническое обеспечение работ этапа 1.

При этом были получены следующие результаты:

1.1 В ходе работы по проекту выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Анализ источников научной литературы показал, что все известные до настоящего времени промоторы генов из двудольных растений по эффективности, как правило, уступают вирусным промоторам, в том числе наиболее часто используемому в генетической инженерии растений промотору CаMV35S. Доступный набор растительных промоторов для биотехнологии двудольных растений ограничен, главным образом, промоторами генов «домашнего хозяйства». В данной ПНИ в качестве нового источника сильных конститутивных и индуцибильных промоторов для генетической инженерии двудольных растений предлагаются промоторы генов антимикробных пептидов из дикорастущего растения мокрицы.

1.2 Теоретические исследования путей использования промоторов генов proSm-AMP1 и proSm-AMP2 из растения мокрицы для получений цисгенных сельскохозяйственных растений, устойчивых к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам среды, позволило сформулировать основные направления экспериментальных работ. В частности исследования должны быть направлены на выяснение транскрипционных свойств промоторов генов proSm-AMP1 и proSm-AMP2 методом делеционного анализа с использованием транзиентной экспрессии генов и в ряду последовательных поколений трансгенных растений. Для выяснения транскрипционных свойств промоторов целесообразно использовать репортерный ген gus, белковый продукт которого позволят количественно и качественно определять активность промоторов при различных методах экспрессии. В качестве сравнительного контроля в работах целесообразно использовать вирусный промотор CaMV35S, транскрипционные параметры которого известны. Выполненные экспериментальные работы позволят обосновать использование генов антимикробных пептидов в качестве нового источника промоторов для создания цисгенных сельскохозяйственных растений, устойчивых к неблагоприятным условиям окружающей среды.

1.3 Проведен патентный поиск, результаты которого свидетельствуют о том, что сильных и, к тому же универсальных по отношению к разным видам растений, промоторов генов двудольных растений, сопоставимых по уровню активности с промотором CMV35S, обнаружено мало и среди них нет промоторов из мокрицы. Поэтому изучаемые промоторы и/или их делеционные варианты могут быть использованы в качестве объектов интеллектуальной собственности.

1.4 Для реализации экспериментальных работ были разработаны методики создания трансгенных растений табака, устойчивых к гигромицину в концентрации 50 мг/л и экспрессирующих ген gus под контролем делеционных вариантов промоторной области гена pro-SmAMP1, pro-SmAMP2 и CaMV35S, разных поколений. Разработана методика создания трансгенных растений картофеля, устойчивых к канамицину в концентрации 100 мг/л и экспрессирующих ген антимикробных пептидов pro-SmAMP2 под контролем делеционного варианта промоторной области гена pro-SmAMP2 и промотора CaMV35S методом агробактериальной трансформации. Разработаны методика агробактериальной инфильтрации растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы, которые позволяют получать в необходимом объеме инфильтрированные растения, экспрессирующие репортерный ген gus под контролем двух делеционных вариантов промоторной области гена pro-SmAMP2 и вирусного промотора CaMV35S.

1.5 Впервые в мире созданы трансгенные растения табака, устойчивые к селективному агенту гигромицину в концентрации 50 мг/л и экспрессирующие ген gus под контролем пяти 5′-делеционных вариантов промоторной области гена pro-SmAMP1 и промотора CaMV35S поколений Т0 и Т1. Получены трансгенные растения табака поколений Т2-Т4, устойчивые к гигромицину в концентрации 50 мг/л и экспрессирующие целевой ген gus под контролем двух 5′-делеционных вариантов промоторной области гена pro-SmAMP2. Созданы трансгенные растения картофеля, устойчивые к селективному агенту канамицину в концентрации 100 мг/л и экспрессирующие целевой ген антимикробных пептидов pro-SmAMP2 под контролем делеционного варианта −2160 п.н. промоторной области гена pro-SmAMP2 и промотора CaMV35S. Получены растения Nicotiana benthamiana, рапса, свеклы, инфильтрированных агробактериальными штаммами GV3101 pMOG35SintGUS, GV3101 рCambia862 и GV3101 pCambia495, и продуцирующие репортерный белок GUS.

1.6 Разработаны лабораторные методики измерения экспрессии целевых генов у трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы, экспрессирующих различные целевые гены под контролем промоторов генов pro-SmAMP1 и pro-SmAMP2.

1.7 Разработана программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов трансгенных растений табака, картофеля и агроинфильтрированных растений Nicotiana benthamiana, рапса и свеклы.

1.8 Индустриальным партнером проекта в рамках софинансирования была проведена закупка Цифрового измерителя температуры. Это оборудование предназначено для измерения температуры в лунках амплификаторов, в том числе, использующихся для изучения экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Дело в том, что температура, которая задается программой амплификатора, не всегда точно соответствует той, которая достигается в лунках при постановке реакции. Случайный градиент температур в лунках аплификаторов требует больших затрат (количества повторений) на разработку тест-систем и снижает точность измерений экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Использование Цифрового измерителя температуры позволяет калибровать лунки аплификатора и при необходимости вводить корректировку задаваемым температурам. Аплификаторы, используемые для разработки методики измерения экспрессии методом ПЦР в реальном времени были проверены с использованием приобретенного прибора.

1.9 Индустриальным партнером были осуществлены пуско-наладочные работы Цифрового измерителя температуры, которые заключались в установке соответствующего программного обеспечения и в обучении персонала.

1.10 За счет собственных средств организации было приобретено оборудование: встряхиватель-шейкер IKA 2526400 KS 501 digital, необходимый для выращивания бактерий при создании трансгенных растений и используемый при создании генетических конструкций и клонировании генов; амплификатор SempliAmp Thermal Cycler АВ-А24811 (блок 96 по 0,2 мл) для поведения ПЦР при анализе экспериментальных образцов трансгенных растений и для создания генетических конструкций.

В целом необходимо отметить, что результаты проекта сопоставимы с мировым уровнем исследований и позволят разработать новые технические решения в области генетической инженерии и биотехнологии растений. Новизна научного решения обусловлена использованием уникальных нуклеотидных последовательностей промоторов генов антимикробных пептидов proSmAMP1 и proSmAMP2 из растения S. media.

Полученные к настоящему времени результаты свидетельствуют о полном их соответствии техническим требованиям к выполняемому проекту, работы по которому должны быть продолжены в соответствии с План-графиком.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Партнеры


























События