НОВОСТИ И ОБЪЯВЛЕНИЯ

22 марта 2021г.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ U6 КЛЕЩЕВИНЫ (RICINUS COMMUNIS L.) И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9

Клещевина — важная сельскохозяйственная культура, которую выращивают во многих странах мира и используют в основном для получения касторового масла, широко применяемого в различных отраслях промышленности. Жмыхи и шроты, которые остаются после отжима масла, богаты белком и перспективны для использования в качестве протеиновых добавок при производстве кормов, однако содержат токсины — белок рицин и алкалоид рицинин. Одним из способов детоксификации клещевины может стать геномное редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9. Эта технология заключается в разрезании целевого участка интактной ДНК ферментом Cas9 при содействии короткого направляющего фрагмента РНК. Доставка в клетку редактируемого растения генов, кодирующих Cas9 и направляющую РНК, часто осуществляется с помощью плазмидных векторов. Для эффективного синтеза направляющей РНК в таких векторах обычно используют промоторы генов, кодирующих малые ядерные РНК. При редактировании двудольных растений чаще всего используют промотор U6 гена арабидопсиса, однако эффективность редактирования повышается, если использовать векторные конструкции с промотором редактируемого растения. Сотрудники ФГБНУ ВНИИСБ впервые провели амплификацию, секвенирование и анализ промоторов гена U6 клещевины. Найденные последовательности были проанализированы и использованы в конструировании CRISPR/Cas9 векторов для дальнейшего редактирования генов рицина. Нашей целью было изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов. В работе использовали растения клещевины ( Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин и Гибзонская. ДНК выделяли из молодых листьев. Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc. Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3. ПЦР проводили на амплификаторе C-100 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Ампликоны очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плазмиду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI («Сибэнзим», Россия) и необходимые олигонуклеотиды. При вырезании продуктов рестрикции из геля их очищали с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Был проведен биоинформационный поиск в базе генетических данных GenBank и обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины. Шесть промоторов, включающих неповрежденные регуляторные элементы USE и ТАТА-бокс, были использованы при подборе праймеров для амплификации на матрице ДНК клещевины сортов Занзибар Грин и Гибзонская. Продукты ПЦР, состоящие из единичных фрагментов, были клонированы и секвенированы. Анализ полученных последовательностей ампликонов показал, что промоторные области полностью совпадали между сортами. Степень идентичности промоторов из разных ампликонов варьировала в пределах 51-77 %. При сравнении этих же промоторов с промоторами гена U6 других растений степень гомологии составляла 42-64 %. Последовательности промоторов, содержащие неповрежденные мотивы USE и ТАТА-бокс, были использованы для конструирования CRISPR/Cas9 векторов, которые могут применяться для эффективного редактирования генов клещевины, участвующих в синтезе рицина и рицинина.

Данные опубликованы:

O.S. Alexandrov, G.I. Karlov SEQUENCING OF THE U6 PROMOTERS IN CASTOR BEANS AND VECTOR CONSTRUCTION FOR CRISPR/Cas9 GENOMIC EDITING ON THEIR BASIS // Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya [Agricultural Biology]. — 2021. — Vol. 56. — № 1. — p. 20-31. — doi: 10.15389/agrobiology.2021.1.20eng 

Партнеры


























События